ENZIMAS: TRABALHO CIENTÍFICO [2] c*

Substâncias

CONT DO [1]: Apresentar-se-ão a seguir os principais procedimentos enzimáticos descritos na literatura utilizando-se extratos enzimáticos e/ou tecidos de diversos vegetais em ordem alfabética dos analitos (substratos) determinados em diversas amostras de interesse alimentício, ambiental, biológico, farmacêutico e industrial. PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS EMPREGANDO TECIDOS E/OU EXTRATOS BRUTOS DE DIVERSOS VEGETAIS Ácido ascórbico A grande maioria dos trabalhos descritos na literatura para determinação enzimática de ácido L-ascórbico utilizam a enzima ascorbato oxidase (EC: 1.10.3.3). A ascorbato oxidase catalisa a oxidação do ácido L-ascórbico na presença de oxigênio molecular produzindo o ácido deidroascórbico e água1,21-24 (Eq. 1). Essa enzima pode ser encontrada em diversos tecidos de vegetais como pepino, abóbora, repolho, alface, uva e melão. O ácido L-ascórbico presente em sucos de frutas naturais oxida-se rapidamente e, em sucos comercializados, a oxidação desse ácido depende da concentração e tipo de antioxidante utilizado, bem como das características da embalagem e condições de armazenamento do produto. Assim, a determinação e/ou monitoramento da vitamina C (ácido L-ascórbico) nesses e em outros produtos comercializados como complexos multivitamínicos e fármacos em geral é de extrema importância. Por outro lado, muitos produtos disponíveis no mercado usam esse ácido como conservante ou agente de retardamento de diversos processos degradativos1,7,62. Há diversos procedimentos enzimáticos para determinação de ácido L-ascórbico descritos na literatura utilizando tecidos e/ou extratos brutos de vegetais como fonte da ascorbato oxidase 63-70. Matsumoto et al.63 imobilizaram ascorbate oxidase de ca  sca de pepino (Cucumis sativus) com glutaraldeído em uma membrana de colágeno e a afixaram em um eletrodo de oxigênio do tipo Clark. Esse biossensor respondeu linearmente no intervalo de concentração de ácido L-ascórbico de 5,0×10-5 a 5,0×10-4 mol L-1 e apresentou uma precisão menor que 2,3% na determinação sucessiva (n=35) de ácido L-ascórbico 0,3 mmol L-1. O tempo de vida desse biossensor foi de 3 semanas (aproximadamente 100 determinações/membrana enzimática) e foi utilizado na determinação desse ácido em sucos de tomate, laranja, limão e morango. Macholan & Chmelikova64  utilizaram fatias com 0,3 mm de espessura de mesocarpo de abóbora (Cucurbita pepo) ou de pepino (Cucumis sativus) na construção de biossensores para ácido L-ascórbico. Esses autores suportaram cada uma dessas fatias sobre uma membrana de PTFE de um eletrodo de oxigênio com o auxílio de uma rede de poliamida e monitoraram o consumo de oxigênio na reação enzimática (Eq. 1) em potencial de – 650 mV vs Ag/AgCl. A curva analítica obtida do decréscimo de corrente, no estado estacionário, em tampão fosfato (pH 6,0) contendo EDTA 0,5 mmol L-1, foi linear para ácido L-ascórbico no intervalo de concentração de 0,02-0,57 mmol L-1. O tempo de resposta desse biossensor variou de 70 a 90 s e cada fatia de tecido foi empregada em 50-80 determinações. Muitos compostos orgânicos como aminoácidos e glicose não interferiram nesse procedimento amperométrico, permitindo assim aplicá-lo na determinação desse analito em tabletes de vitaminas e em sucos de diversas frutas. A alta seletividade desse biossensor é atribuída à seletividade da membrana microporosa de PTFE (Teflon) que permite a difusão apenas de moléculas gasosas. Dois procedimentos amperométricos para determinação de ácido L-ascórbico em sucos de frutas e fluídos biológicos foram propostos por um grupo de pesquisa pernambucano65,66. Esses pesquisadores usaram extrato de pepino (Cucurbita maxima) imobilizado com glutaraldeído em uma membrana de um eletrodo de oxigênio65, usado como sensor base. Esse biossensor apresentou uma resposta linear de 62,5 a 500 µmol L-1 de ácido L-ascórbico com um tempo de vida superior a 2 meses. Em um sistema de análise por injeção em fluxo66, o extrato bruto de pepino foi imobilizado em esferas de vidro. Um eletrodo de oxigênio foi usado para monitorar o decréscimo linear da concentração de oxigênio na faixa de 0,05-3,00 mmol L-1 de ácido L-ascórbico. Com um reator acoplado nesse sistema foi possível realizar 600 determinações com uma freqüência analítica de 90 h-1. Esaka et al.67 imobilizaram ascorbato oxidase de abóbora (Cucurbita pepo) em 6% m/m de esferas de gel de alginato de cálcio tratado com solução de glutaraldeído 1% v/v durante 20 h, a 4 °C. O biossensor foi aplicado na determinação de ácido L-ascórbico em sucos de laranja, tomate, uva e morango em um intervalo de concentração de 2 a 20 mg/mL. Testes de adição e recuperação desse ácido nesses sucos de frutas variaram de 81,5 a 89% e a enzima permaneceu ativa após um período de 3 meses (50 determinações), quando o eletrodo foi armazenado a 15 °C em um intervalo de pH de 5 a 7. Uchiyama et al.68 usaram suco de pepino (Cucumis sativus L.) como fonte da enzima ascorbato oxidase como reagente transportador em um sistema de análise por injeção em fluxo e determinaram amperometricamente ácido L-ascórbico. O consumo de oxigênio decresceu linearmente no intervalo de concentração de 5,0×10-4 a 7,0x 10-3 mol L-1 de ácido L-ascórbico. Os autores enfatizaram a vantagem da não necessidade de purificação da enzima presente no suco de pepino (extrato bruto enzimático). A adição de azida de sódio na solução transportadora, para prevenir a putrefação dessa solução enzimática, pode ser crítica, uma vez que essa substância inibe a atividade da ascorbato oxidase. Desta maneira, o emprego de azida de sódio para estabilizar o extrato bruto de pepino pode comprometer significativamente a atividade da ascorbato oxidase, não sendo assim indicada nesses processos de estabilização. A atividade enzimática permaneceu constante por 8 dias, quando o suco de pepino foi armazenado a 4 °C e o procedimento em fluxo foi empregado apenas na determinação de ácido L-ascórbico em soluções de referência (padrão). Como discutido, o procedimento de obtenção do extrato enzimático é de extrema importância no desempenho do procedimento analítico. Nesse trabalho os autores deveriam ter investigado outros agentes protetores. Estudos em andamento em nosso laboratório, indicam que as PVPs são muito mais efetivas para a estabilização desse extrato enzimático. Extratos de pepino (Cucumis sativus L.) obtido com o procedimento desenvolvido tem levado a estabilização enzimática por períodos superiores a 2 meses, quando armazenado a 4 °C, mostrando assim ser muito superior aquele empregando a azida de sódio. Uchiyama & Umetsu69 impregnaram suco de pepino em uma fina camada de feltro de carbono de um eletrodo de oxigênio e determinaram amperometricamente ácido L-ascórbico em uma faixa linear de concentração de 2,5×10-4 a 1,6×10-3 mol L-1. O teor desse ácido em sucos de laranja e de morango foi determinado e o sistema amperométrico necessitou de calibrações periódicas devido ao lixiviamento do suco de pepino do biossensor. Fernandes et al.70 desenvolveram um biossensor potenciométrico imobilizando-se ascorbato oxidase extraída do epicarpo de pepino (Cucumis sativus L.) em um eletrodo de grafite-epóxi por oclusão em uma matriz de polietileno-vinilacetato 40% m/m. O eletrodo apresentou uma linearidade de 8,0×10-6 a 4,5×10-4 mol L-1 e inclinação de 50,3±0,6 mV/década. O biossensor foi utilizado continuamente durante 15 dias (cerca de 300 determinações) e manteve-se estável por um mês quando armazenado à temperatura de 4 °C. O tempo de resposta foi de 5 min e esse biossensor foi aplicado na determinação dos teores de ácido ascórbico em diversos produtos farmacêuticos. Uma alternativa inédita explorada pelo nosso grupo de pesquisa para a determinação desse ácido foi desenvolvida recentemente44. Trata-se da construção de um eletrodo de pasta de carbono modificado com extrato bruto de abobrinha (Cucurbita pepo) como fonte da enzima peroxidase (PER). Essa enzima na presença de peróxido de hidrogênio (H2O2) catalisa a oxidação da hidroquinona (H2Q) a p-quinona (Q), a qual foi reduzida eletroquimicamente ao reagente (substrato) de partida em potencial de -0,14V, fornecendo uma corrente de pico catódica proporcional a sua concentração no intervalo de 2,0×10-4 a 5,5×10-3 mol L-1 e limite de detecção de 2,2×10-5 mol L-1. Desta maneira, quando a solução de ácido L-ascórbico (AA) é adicionada na solução de hidroquinona, esse ácido pode reduzir quimicamente p-quinona a hidroquinona, reagir com oxigênio dissolvido, reduzindo-se a ácido deidroascórbico (ADA) e/ou inibir a enzima peroxidase, decrescendo dessa maneira o pico de corrente proporcionalmente ao aumento de sua concentração. A Figura 2 mostra uma representação esquemática do processo enzimático entre a hidroquinona, peróxido de hidrogênio, ácido L-ascórbico e peroxidase. O biossensor apresentou um bom desempenho analítico, um tempo de vida superior a 7 meses (mais de 900 determinações por quantidade de pasta embutida em cada seringa) e um desvio padrão relativo de 1,3 % para soluções de ácido ascórbico 4,0×10-3 mol L-1. A alta estabilidade desse e de outros biossensores desenvolvidos em nosso laboratório é atribuída principalmente ao procedimento de obtenção e estabilização dos extratos enzimáticos com polivinilpirrolidonas (PVPs)30-44, que são reconhecidamente um dos compostos mais eficientes empregados na remoção de substratos naturais56, geralmente envolvidos nos processos de diminuição da atividade de diversas enzimas. Ácido oxálico A oxalato oxidase (EC: 1.2.3.4) catalisa a oxidação do ácido oxálico produzindo dióxido de carbono e peróxido de hidrogênio (Eq. 2). Essa enzima é encontrada em polpa de banana, tecido de espinafre e sementes de alguns vegetais21,24. Oxalato foi determinado potenciometricamente em amostras de urina, plasma e alimentos com um biossensor construído com um eletrodo seletivo a dióxido de carbono71 contendo polpa de banana immobilizada. Em um outro trabalho, oxalato foi determinado amperometricamente, monitorando-se o peróxido de hidrogênio72 produzido na reação enzimática (Eq. 2) com um biossensor construído com polpa de banana e um eletrodo do tipo Clark73,74 polarizado em potencial de + 600 mV. Qin et al.75 desenvolveram um biossensor para quantificação de oxalato usando tecido de espinafre empacotado em uma coluna de troca iônica contendo luminol e cobalto(II). As medidas por quimioluminescência em sistema de análise por injeção em fluxo do peróxido de hidrogênio produzido na reação enzimática foram feitas com o emprego de luminol e cobalto(II). A intensidade de emissão da luz foi proporcional à concentração de oxalato de 0,6 a 100 µmol L-1. O biossensor apresentou um limite de detecção de 0,2 µmol L-1 e foi possível realizar 300 determinações/h. Fernandes et al.76 usaram sementes de sorgo (Sorghum vulgare seeds, variedade BR303) como fonte da enzima oxalato oxidase (E.C: 1.2.3.4.) no desenvolvimento de um novo biossensor para oxalato. O dióxido de carbono produzido na reação enzimática foi monitorado com um eletrodo para CO2 e esse sensor mostrou-se estável durante um mês (200 determinações). O tempo de resposta foi de 60 s e uma linearidade de 1,0×10-3 a 4,0×10-3 mol L-1 de oxalato foram obtidos. Empregando esse mesmo material biológico, Oliveira-Neto et al.77 desenvolveram um procedimento em fluxo com detecção condutométrica para determinação de oxalato em urina. Uma curva analítica para oxalato em concentrações variando de 0,05 a 0,5 mmol L-1 foi obtida e os teores desse analito encontrados em várias amostras empregando esse sistema em fluxo foram comparados com aqueles teores empregando o mesmo sistema em fluxo, mas com enzima pura (r=0,9995). Fonong71 imobilizou fisicamente polpa e casca da banana na extremidade de um eletrodo para dióxido de carbono e em um sensor para peróxido de hidrogênio para monitorar potenciometricamente e amperometricamente oxalato em urina, respectivamente. A resposta potenciométrica obtida foi de 47-50 mV/dec para 1,0×10-4 a 2,0x 10-3 mol L-1 e uma linearidade de 2,0×10-5-3,0×10-4 mol L-1 de oxalato foi obtida nas medidas amperométricas. Álcool etílico No procedimento para determinação de álcool etílico usando alcool desidrogenase (EC: 1.1.1.2), um biossensor pode monitorar a espécie eletroativa NADH produzida na reação enzimática (Eq. 3), enquanto que o consumo de oxigênio na reação NADH (Eq. 4) pode ser monitorado com um eletrodo para oxigênio do tipo Clark18. Diversos procedimentos alternativos para determinação de álcoois, aldeídos e ácidos carboxílicos de cadeia curta usando álcool desidrogenase purificada podem ser encontrados em monografias especializadas18,21-24, como espectrofotométricos, fluorimétricos, condutométricos e quimioluminescentes. Ozsoz & Wang78 construíram um biossensor de pasta de carbono contendo semente de tomate como fonte da alcool desidrogenase e determinaram alguns álcoois de cadeia curta. As sementes secas de tomate foram imersas em água por 24 h, maceradas e suas cascas removidas. A parte interna dessas sementes foi misturada convenientemente com 0,6 g de pó de grafite e 0,4 g de óleo mineral. Uma parte dessa pasta foi então embutida na extremidade inferior de um tubo de vidro (3 mm de d. i.) e o contato elétrico externo foi feito com um fio de cobre. Com uma célula eletroquímica contendo como eletrodo indicador o biossensor de tecido, um eletrodo auxiliar de platina e um eletrodo referência de Ag/AgCl, esses autores determinaram os teores de etanol e álcool alílico. Outras fontes alternativas da enzima alcool desidrogenase que podem ser empregadas no desenvolvimento de biossensores e/ou métodos enzimáticos de análise incluem as sementes de algodão (Gossypium hirsutum cv. Siokra)79, de girassol (Helianthus annus)80, soja (Glycine max)81, pimentão (Capsicum annuum)82, amendoim (Arachis hypogaea)83, tabaco (Nicotiana sylvestris)84, tecidos de morango (Fragaria xananassa Duch)85, oliva (Olea europaea)86 e beterraba (Beta vulgaris)87. Essas alternativas de emprego desses materiais biológicos são de extrema importância para as indústrias sucro-alcoleiras, uma vez que o monitoramento dos teores de etanol nos processos fermentativos pode levar a maior produtividade dessa substância importante para a economia nacional. Aminas As amina oxidases são grupos de enzimas que catalizam a oxidação de aminas primárias, diaminas e poliaminas pelo oxigênio molecular aos aldeídos correspondentes, peróxido de hidrogênio e amônia, como representado pela Equação 588: onde R1, R2 representam H ou grupo alquila e R3 e R4, H, alquila ou arila. São conhecidos dois tipos principais de amina oxidases89, aqueles contendo cobre (Cu-AOs; EC: 1.4.3.6) e amino oxidases contendo flavina (FAD-AOs; EC: 1.5.3.3). Em 1948, Werle et al.90 observaram pioneiramente a atividade da amino oxidase em extratos de plantas. Desde então, a amina oxidase foi encontrada nas seguintes espécies de plantas: aveia (Avena sativa), pepino (Cucumis sativas), soja (Glicine max), semente de ervilha (Pisum sativum), folha de Onobrychis viciifolia, semente e folha de Vicia faba, entre outras91-94. Esses materiais biológicos supramencionados podem ser empregados na construção de biossensores e/ou procedimentos enzimáticos de análise para determinação de diversas aminas de interesse, constituindo assim num nicho importante de investigação. Sebela et al.95 estudaram a amino oxidase de ervilhas por polarografia de pulso diferencial. Polarogramas dessa enzima em tampão fosfato 50 mmol L-1 (pH 7) e aqueles obtidos após reação da amino oxidase separadamente com os reagentes dietilditiocarbamato, dietilpirocarbonato e borohidreto de sódio, indicaram que a quinona (cofator) e íons cobre ligados ao centro ativo, são os centros de oxidação-redução dessa metaloproteína. Entretanto, muitos estudos visando melhor compreensão da atividade catalítica dessa enzima poderão ser ainda explorados. Wimmerova & Macholan96 construíram um biossensor amperométrico para diversas aminas primárias e secundárias, imobilizando tecido de ervilha (Pisum sativum), como fonte da enzima amino oxidase em um eletrodo de pasta de carbono. Considerando as fontes vegetais disponíveis no Brasil da enzima amino oxidase e o pequeno número de biossensores descritos na literatura especializada, há certamente muitas possibilidades de construção de novos biossensores para várias aminas em amostras diversas. Compostos fenólicos